Kichik hujayradan tashqari pufakchalarni samarali tayyorlash uchun ultratsentrifugalash bilan birlashtirilgan TFF tangensial oqim filtratsiyasi

Kichik hujayradan tashqari pufakchalar (sEV) - nuklein kislotalar, oqsillar, kichik molekulalar va boshqa komponentlarni o'z ichiga olgan hujayralar tomonidan ajralib chiqadigan nano o'lchamdagi pufakchalar va hujayralararo aloqada muhim rol o'ynaydi. Ekzosoma{1}}turdagi mayda hujayradan tashqari pufakchalar ota-ona hujayralari bilan juda oʻxshash. Sun'iy nanopartikullar bilan solishtirganda, ular pastroq immunitetni tozalash tezligini va past sitotoksiklikni namoyish etadilar, bu ularni yangi nomzod sifatida istiqbolli qiladi.in vivo dori vositalarini etkazib berish. Deyarli barcha turdagi hujayralar bu pufakchalarni ajratishi mumkin va ularni dori tashuvchisi sifatida qo'llash bo'yicha tadqiqotlar asta-sekin laboratoriyadan klinik dasturlarga o'tadi. Biroq,yirik{0}}miqyosdagi ishlab chiqarish asosiy to‘siq bo‘lib qolmoqda.

 

Hujayradan tashqari vesikulalarni izolyatsiya qilishning hozirgi usullari

Hujayradan tashqari pufakchalarni izolyatsiya qilishning hozirgi usullariga quyidagilar kiradiultratsentrifugalash, zichlik gradienti sentrifugalash, oʻlcham-tashqari xromatografiya (SEC) va polietilen glikol (PEG) choʻkmasi.

PEG yog'inlari yuqori rentabellik va oddiy ishlashni taklif qiladi, ammo u kiruvchi oqsillar bilan sezilarli ifloslanish bilan bog'liq. Zichlik gradienti santrifüjlash va oʻlchamni-tashqariga chiqarish xromatografiyasi yuqori-toza mahsulotlarni taqdim etishi mumkin, ammo ularning samaradorligi nisbatan past va jarayonlar-koʻp vaqt talab etadi. Ultratsentrifugalash keng tarqalgan bo'lib qo'llaniladi, lekin uni qayta ishlash hajmi santrifuga sig'imi bilan cheklangan, bu esa masshtabni kengaytirishni qiyinlashtiradi.

 

sEV ajratish uchun tangensial oqim filtratsiyasini qo'llash

Tangensial oqim filtratsiyasi (TFF) allaqachon lipozomalar va lentiviral vektorlar kabi nanozarrachalarni ajratish uchun qo'llanilgan. TFFda ozuqa membrana yuzasi bo'ylab tangensial tarzda oqadi, bu membrananing ifloslanishini kamaytirishga yordam beradi va jarayonni kengaytirishni osonlashtiradi.

Kichik hujayradan tashqari pufakchalar odatda o'zgarib turadi30–200 nmdiametrida, a0,45 mkm membranali kassetakattaroq oqsillar va pufakchalarni olib tashlash uchun TFF tizimida tanlanishi mumkin, shu bilan birga a300 kDa membranali kassetakichik molekulyar og'irlikdagi oqsillarni-olib tashlash va madaniy muhitda mavjud bo'lgan kichik hujayradan tashqari pufakchalarni konsentratsiyalash uchun ishlatilishi mumkin.

 

TFF ajratilgandan keyin xomashyoning xarakteristikasi

Nanopartikullarni kuzatish tahlili (NTA) shuni ko'rsatdiki, zarrachalar diametrlari asosan diapazonda taqsimlangan.0–250 nm.

 

 

Biroq, transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) ko'p miqdorda ifloslantiruvchi oqsilni aniqladi, shu bilan birga hujayradan tashqari pufakchalar kuzatilmadi. Ushbu natijalar hujayradan tashqari vesikulalarni yanada tozalash uchun quyi oqimning qo'shimcha tozalash bosqichi zarurligini ko'rsatdi.

 

100 kDa ultrafiltratsiyadan so'ng TFF kontsentratining xarakteristikasi

TFF konsentrati qo'shimcha ravishda a yordamida qayta ishlandi100 kDa ultrafiltratsiya trubkasi.

NTA shuni ko'rsatdiki, bir va ikki tur ultrafiltratsiyadan so'ng olingan kontsentratlardagi zarrachalar diametrlari asosan diapazonda saqlanib qolgan.0–250 nm. Biroq, ultrafiltratsiyani ikki marta bajarish natijasida olingan zarrachalar soni sezilarli darajada qisqardi.

TEM tahlili shuni ko'rsatdiki, bir martalik yoki ikki martalik ultrafiltratsiya konsentratlarida pufakchaga o'xshash tuzilmalar kuzatilmagan, shu bilan birga katta miqdorda ifloslantiruvchi oqsil saqlanib qolgan.

Shuning uchun,100 kDa ultrafiltratsiyani TFF konsentratsiyasidan keyin madaniyat muhitini tozalash uchun samarali ishlatish mumkin emas edi.

 

 

Ultratsentrifugalash orqali tozalangan TFF konsentratining tavsifi

NTA tozalangan mahsulotlarning zarracha diametrlari asosan diapazonda taqsimlanganligini ko'rsatdi0–250 nm.

Muhimi, TEM turli ko‘rish sohalaridagi pufakchalar{0}}o‘xshash tuzilmalarni aniq ko‘rsatdi. Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, TFF yordamida madaniy muhitni kontsentrlangandan so'ng,Keyinchalik hujayradan tashqari vesikulalarni ajratish va tozalash uchun ultratsentrifugalashdan foydalanish mumkin..

 

 

Ultratsentrifugalash bilan birlashtirilgan TFF yordamida mezenximal ildiz hujayralarining shartli muhitidan ajratilgan sEVlarning tavsifi

NTA tozalangan mahsulotlarning zarracha diametrlari asosan diapazonda taqsimlanganligini ko'rsatdi0–250 nm.

TEM tomonidan{0}}vesikulyar tuzilmalar kuzatilgan. Western blot tahlili hujayradan tashqari pufakchalar-bog'langan oqsillarning ijobiy ifodasini ko'rsatdi.CD9, CD63 va ALIXtozalangan hujayradan tashqari pufakchalarda.

Ushbu natijalar tozalangan kichik hujayradan tashqari pufakchalarda ekzosomalar mavjudligini tasdiqladi, bu esa bu usuldan ham foydalanish mumkinligini ko'rsatadi.ekzosoma izolyatsiyasi va ekstraktsiyasi.

 

 

Xulosa: Yuqori-Sifatli sEV tayyorlash uchun TFF ultratsentrifugalash bilan birlashtirilgan

Tadqiqot shuni ko'rsatdiFaqat TFF konsentratsiyasiko'p miqdorda ifloslantiruvchi oqsillarni o'z ichiga olgan mahsulotga olib keldi va shuning uchun malakali hujayradan tashqari pufakchalarni olish uchun etarli emas edi.

Xuddi shunday, a yordamidaIkkilamchi tozalash uchun 100 kDa ultrafiltratsiya trubkasibuzilmagan vesikulyar tuzilmalarni samarali ravishda bermadi.

TFF konsentratsiyasini keyingi ultratsentrifugali tozalash bilan birlashtirib, ikkala texnikaning afzalliklarini olish uchun birlashtirilishi mumkin.yuqori-sifatli kichik hujayradan tashqari pufakchali mahsulotlar.

Faqatgina an'anaviy ultratsentrifugalash bilan solishtirganda, kombinatsiyalangan jarayon samarali bo'lishi mumkinumumiy ishlov berish vaqtini qisqartirish va ajratish samaradorligini oshirish.

Ushbu ish jarayonida,TFF katta hajmdagi namunalarni-tez boyitish imkonini beradi, katta namuna hajmlarini qayta ishlashda an'anaviy ultratsentrifugalashning cheklanishiga murojaat qilish. Keyin ultratsentrifugalash pufakchalarning tozaligi va yaxlitligini saqlashga yordam berib, ko-konsentrlangan oqsil aralashmalarini olib tashlash uchun chuqur tozalashni amalga oshiradi.

Bundan tashqari, jarayon qo'shimchani talab qilmaydiekzogen kimyoviy cho'kma reagentlari, vesikulalarning biologik faolligini maksimal darajada saqlab qolishga yordam beradi.

Sanoat tarjimasi nuqtai nazaridan bu jarayon muhim ahamiyatga egapotentsial-ko‘paytiringva hujayradan tashqari pufakchalarni-keng miqyosda ishlab chiqarish bilan bog'liq muammolarni hal qilishga yordam beradidori vositalarini yetkazib berish, regenerativ tibbiyot va tegishli mahsulotlarni ishlab chiqish. Shuningdek, u keyingi jarayonlarni optimallashtirish va tajriba{1}}miqyosda ishlab chiqarish uchun mustahkam eksperimental asos yaratadi.

 

Malumot

Vang Ling, Li Mengshi, Xu Sha va boshqalar.Ultratsentrifugalash bilan birlashtirilgan tangensial oqim filtrlash orqali kichik hujayradan tashqari vesikulalarni ajratish usulini yaratish. Xitoy biologik jurnali, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.