Ultrafiltratsiyali santrifüj quvurlari uchun eksperimental ilovalar va muammolarni bartaraf etish echimlari

Ultrafiltratsiyali santrifüj trubkasi laboratoriyada tez-tez ishlatiladigan membranani filtrlash qurilmasi hisoblanadi. Uning asosiy komponenti ma'lum bir molekulyar og'irlik chegarasiga ega bo'lgan ultrafiltratsiya membranasidir. Keng tarqalgan ultrafiltratsion membrana materiallari orasida polietersulfon (PES) va qayta tiklangan tsellyuloza (RC) mavjud. Ultrafiltratsiyali markazdan qochma trubkaning ishlash printsipi markazdan qochma kuch va molekulyar{4}}oʻlchamga asoslangan elakdan foydalanib, ultrafiltratsiya membranasi orqali kichik molekulalarni oʻtkazish, shu bilan oqsillar va yadrolar kabi biomakromolekulyarlarni tez kontsentratsiyalash, tuzsizlantirish, bufer almashinuvi yoki tozalash va ajratish imkonini beradi.

 

MWCO tanlovi

Protein	Tavsiya etilgan MWCO	Tavsiya etilgan santrifüjlash vaqti
6–20 kDa	3 kDa	40 min
20–30 kDa	5 kDa	30 min
30–60 kDa	10 kDa	20 min
60–100 kDa	30 kDa	20 min
100–200 kDa	50 kDa	15 min
200–600 kDa	100 kDa	15 min
>600 kDa	300 kDa	15 min
Yagona- yoki ikki{1}}torli nuklein kislota molekulalari	Tavsiya etilgan MWCO	Tavsiya etilgan santrifüjlash vaqti
137–1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 min (sobit{1}}burchakli rotor, 5000 × g)
Nanoboncuklar	Tavsiya etilgan MWCO	Tavsiya etilgan santrifüjlash vaqti
1,5-2 nm	3 kDa	40 min
2-3 nm	5 kDa	30 min
3-5 nm	10 kDa	20 min
5–7 nm	30 kDa	20 min
7–10 nm	50 kDa	15 min
10–30 nm	100 kDa	15 min
>30 nm	300 kDa	15 min

 

Proteinlar uchun maqsadli oqsilning molekulyar og'irligidan 2-6 baravar past bo'lgan MWCO membranasini tanlash tavsiya etiladi. Agar oqim tezligi ham hisobga olinsa, MWCO membranasi ushbu 2×–6× diapazondan past bo'lishi tavsiya etiladi.

 

Qo'llash ishi (to'kilgan hujayralardan olingan DNK)

An'anaviy usul uchun 2,5 sm × 2 sm o'lchamdagi doka bo'lagi kesilib, kichik{2}}hajm tizimida lizing qilindi va asbob yordamida bevosita tozalandi. Konsentratsiyalash usuli uchun doka namuna olish maydoni ikki barobarga oshirildi. Lizisdan so'ng, hazm qilish supernatanti 100 kDa ultrafiltratsiyali santrifüj trubasiga o'tkazildi, 10000 r / min tezlikda santrifüjlash orqali konsentratsiya qilindi, teskari santrifüjlash orqali tiklandi va keyin to'liq avtomatlashtirilgan nuklein kislotasini tozalash vositasi yordamida DNK ekstraktsiyasiga duchor bo'ldi. Ikki guruhdagi hujayralarning boshlang'ich darajalari deyarli bir xil bo'lishini ta'minlash uchun elutsiya hajmi bir xilda 40 mL ga o'rnatildi.

 

Miqdoriy testlar shuni ko'rsatdiki, o'rtacha DNK kontsentratsiyasi an'anaviy usul uchun 0,099 ± 0,041 ng/mkL va konsentratsiya usuli uchun 0,193 ± 0,068 ng/mkL edi. Ikki guruh o'rtasidagi farq statistik jihatdan ahamiyatli edi (P <0,01). Konsentratsiya usuli bilan olingan umumiy DNK hosilasi an'anaviy usuldan 1,95 baravar ko'p bo'lib, ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi bosqichi umumiy DNKda deyarli yo'qotishlarga olib kelmasligini ko'rsatdi. Ikki guruhning Ct qiymatlari mos ravishda 27,64 ± 0,39 va 27,58 ± 0,40 bo'lib, P> 0,01 bo'lib, bu ultrafiltratsiya bilan davolash PCR kuchaytirish inhibitörlerini kiritmaganligini yoki keyingi kuchaytirish reaktsiyalariga xalaqit bermaganligini ko'rsatadi.

 

STR genotiplash uchun to'liq genotip har bir lokusda to'liq chiziqlar va 200 RFU dan katta yoki unga teng bo'lgan o'rtacha cho'qqi balandligi bilan aniqlangan. 20 ta parallel namunalar orasida an'anaviy usul atigi 14 ta namuna uchun to'liq genotiplarni berdi, kontsentratsiya usuli esa barcha 20 ta namunalar uchun to'liq STR genotipiga erishdi, bu esa iz kontakt namunalarining samarali genotipini aniqlash tezligini sezilarli darajada oshirdi.

Guidling Technology ultrafiltratsiya santrifüj quvurlari oddiy operatsiya, yuqori konsentratsiyali omillar va yuqori namunani qayta tiklash tezligiga ega va biokimyo, molekulyar biologiya va boshqa sohalarda keng qo'llaniladi. Guidling Technology ultrafiltratsiyali santrifüj quvurlarining tiklanish darajasi qayta ishlangan materialga qarab o'zgaradi va odatda 90% dan oshishi mumkin.

 

Umumiy nosozliklarni bartaraf etish

Muammo	Mumkin sabab	Yechim
Konsentratsiya paytida yog'ingarchilik paydo bo'ladi	Konsentratsiya juda tez	Santrifüj tezligini kamaytiring
		Yuqori molekulyar og'irlik chegarasi bo'lgan ultrafiltratsiya naychasidan foydalaning
		Santrifüj trubkasida pipetka bilan yuqoriga va pastga torting, keyin yana santrifuga qiling
	Haddan tashqari-kontsentratsiya	Konsentratsiyadan keyin oxirgi protein kontsentratsiyasi 20 mg / ml dan oshmasligi tavsiya etiladi
Suvni filtrlab bo'lmaydi	Ultrafiltratsiya membranasi butunlay quruq bo'lib, membrana yuzasi zaif hidrofobik bo'ladi	Membranani past kuchlanishli{0}}erituvchi-bilan namlang (masalan, suvda 20% etanol bilan dastlabki sentrifuga qiling)
Konsentratda maqsadli protein mavjud emas	Protein namunasining dastlabki konsentratsiyasi juda past (< 25 μg/mL)	Namuna konsentratsiyasi past va hajmi katta bo'lsa, namunani qayta-qayta yuklang va santrifüj qiling
	Noto'g'ri membranani MWCO tanlash	MWCO membranasi odatda maqsadli oqsilning molekulyar og'irligidan 2 baravar kam yoki undan kattaroqdir
	Santrifüj kuchi belgilangan diapazondan tashqarida	Tavsiya etilgan markazdan qochma kuchi: 3000–5000 × g
	Maqsadli protein cho'kdi	Konsentratdagi maqsadli oqsil kontsentratsiyasini sozlang (kontsentratsiya faktorini sozlang)
		Harorat va pH ni nazorat qiling
		Qo'shimchalardan foydalaning
		Ion kuchini sozlang
Konsentrlangan oqsilni quyi oqim tahlili paytida shovqin paydo bo'ladi	Ultrafiltratsiya membranasida glitserinning iz miqdori mavjud	Ultrafiltratsiya trubkasini bufer va tozalangan suv bilan-oldindan yuving. Agar shovqin davom etsa, 0,1 M NaOH bilan tozalang, keyin tozalangan suv bilan yuving va quriting.
RNaz bilan ifloslanish	Ultrafiltratsiya trubkasi RNase-bo'lmasligi kafolatlanmaydi	RNazni to'liq inaktivatsiya qilish uchun 0,1% DEPCda 37 daraja haroratda 2 soat davomida namlash tavsiya etiladi; DEPC qoldiqlarini tozalangan suv bilan yuvish orqali olib tashlash mumkin
Endotoksin bilan zaharlanish	Taqdim etilgan ultrafiltratsiya naychalari endotoksinlarni olib tashlash{0}}davosidan o'tmagan va endotoksinlar tabiatda keng tarqalgan.	Tajribadan oldin,{0}}0,5 M NaOH bilan oldindan tozalang, so'ngra ko'pchilik endotoksinlarni olib tashlash uchun tozalangan suv bilan yuving.